宰后肉品嫩化技術及其作用機理研究進展

　　摘要：嫩度是表征肉品食用品質的重要指標，消費者對肉品嫩度期望感利于重復購買。由肌肉轉變為可食用肉，涉及復雜的生理生化過程，宰后肉類成熟與嫩化處理可有效改善肉品品質。本文就當前宰后肉品成熟機制、嫩化技術（生物、化學、物理）及相關機理進行綜述，并輔以圖解與展望，從而為宰后肉品半加工或全加工提供理論參考。

　　關鍵詞：肉品；成熟；嫩化技術；嫩化機理；圖解

　　肉品嫩度是消費者購買肉與肉制品的首要衡量標準，作為一種復雜的品質特性，嫩度受宰前與宰后多種因素的影響。調控宰前嫩度主要通過飼料種類及管理技術，該過程具有系統性與長期性。而宰后嫩化方法較多，短時高效，更易獲得品質優良的商業化產品。肉品嫩度受內外因素影響，內部因素包括：結締組織數量和膠原蛋白溶解度、僵直過程中的肌節短縮以及可影響宰后肌原纖維及肌原纖維相關蛋白水解的鈣蛋白酶/鈣蛋白酶抑制蛋白等。而外部因素如肌纖維變性、收縮及相關水分損失的平衡、熱處理引起的增韌、蛋白溶解/凝膠化等均會影響嫩度。肉品嫩度作為肉品品質與質地的表征特性之一，決定肉品烹調與加工后的感官體驗。關于宰后肉品嫩化方法的報道屢見不鮮，部分技術作用機理存在爭議與不足，本文將從肉品成熟嫩化理論、宰后嫩化方法及相關機理解釋(主要針對新興嫩化技術)等方面進行綜述。

　　1  肉品嫩化理論及成熟機制

　　宰后畜禽肉伴隨著僵直、解僵、成熟和腐敗等一系列生理生化變化過程，可引起膠原蛋白含量/溶解度、肌肉短縮程度及成熟過程中結構蛋白的變化，肉品保水性、色澤、嫩度等受到影響。肉品成熟機制的研究由來已久，包括鈣蛋白酶學說、鈣張力學說、鈣離子學說、組織蛋白酶學說，該節僅對主流鈣蛋白酶嫩化肉品機理及當前普遍接受的成熟機制進行綜述。

　　1.1.1  鈣蛋白酶體系

　　當前研究表明，參與宰后肌肉蛋白質降解的蛋白酶中以鈣蛋白酶(calpain)起主要作用。calpain的蛋白水解活性受肌漿Ca2+濃度、鈣蛋白酶抑制蛋白/鈣蛋白酶比例、pH值、溫度和氧化等內外環境因素的影響，鈣蛋白酶體系包括鈣依賴性半胱氨酸蛋白酶的calpain及其抑制蛋白(均需Ca2+激活)。鈣蛋白酶亞型眾多，以μ-鈣蛋白酶(μ-calpain，結合肌原纖維為主)和m-鈣蛋白酶(m-calpain，位于細胞溶質)研究最為深入。μ-calpain與m-calpain 均可水解肌原纖維，但后者激活所需Ca2+濃度遠高于前者，宰后成熟過程中活性幾乎不變，且兩者宰后作用時間不同。μ-calpain宰后前3天即被激活并伴隨自溶，發揮其水解蛋白活性，降解肌肉中主要的肌原纖維蛋白，而m-calpain宰后成熟前期并未被激活，可能在嫩化末期發揮作用，故普遍認為是μ-calpain而非m-calpain參與肉品嫩。

　　鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)可抑制蛋白酶水解活化、膜結合和催化活性的表達。畜禽宰后，肌肉中calpastatin含量逐漸減少，其降解/失活的速度與肌肉中蛋白質的水解有關，通過與μ-calpain和m-calpain之間的相互作用共同參與調控宰后嫩度。

　　其次，宰后肌肉中存在大量可磷酸化鈣蛋白酶系統的蛋白激酶，因此具備發生磷酸化的條件。具備肌肉收縮功能的蛋白質如肌鈣蛋白磷酸化后會降低鈣蛋白酶對其降解的能力，宰后糖酵解酶磷酸化后酶活性改變，進而影響糖酵解進程、肌肉僵直過程及最終的肉品品質。宰后肌肉中，μ-/m-calpain與calpastatin磷酸化是否會影響其自身活性，進而影響嫩化進程，磷酸化calpastatin如何影響對calpain的抑制能力等，這些問題仍需進一步研究驗證，以便明確鈣蛋白酶系統在動物宰后肌肉中的活性調控機制，豐富和發展鈣蛋白酶嫩化理論，為改善肉品質提供新的思路。

　　1.1.2  鈣蛋白酶嫩化機理

　　鈣蛋白酶可降解肌原纖維中的關鍵蛋白質，包括伴肌動蛋白、肌聯蛋白、肌鈣蛋白-T和肌間線蛋白等；亦可破壞肌肉超微結構、Z線弱化并消失，促進肌原纖維小片化，改善肌肉嫩度。鈣蛋白酶嫩化作用表現為圖1(略)：(1)鈣蛋白酶降解伴肌球蛋白與伴肌動蛋白、弱化細線與Z線的相互作用，引起肌原纖維I帶和Z線結合變弱或斷裂；(2)鈣蛋白酶降解肋節、肌間線蛋白和絲蛋白后，肌纖維有序結構被破壞、破壞肌纖維與外周或肌纖維之間的完整性；(3)鈣蛋白酶降解類原肌球蛋白，弱化粗細絲之間的鍵合，刺激解僵；(4)促進肌鈣蛋白中原肌球蛋白結合亞基肌鈣蛋白-T(Troponin-T，Tn-T)的降解，弱化細絲結構，提高嫩度。

　　1.2  肉品成熟機制

　　目前廣泛提出的一種多機制共同成熟作用如圖2所示。即(1)鈣蛋白酶在肌肉成熟嫩化過程中起主導作用，鈣離子通過激活該酶而發揮間接作用；(2)細胞凋亡酶參與了早期階段的肌肉成熟，對肌聯蛋白和伴肌動蛋白有降解作用，調控鈣激活酶系統；(3)鈣蛋白酶作為一種半胱氨酸蛋白酶，蛋白質巰基亞硝基化通過修飾鈣蛋白酶活性位點的半胱氨酸殘基，影響其自溶性與蛋白水解活性；capase-3(一種細胞凋亡酶)去硝基化可被激活，進而誘導細胞凋亡；蛋白亞硝基化還可修飾鈣離子釋放通道，影響其釋放速度，引起肌肉不同程度的收縮及細胞內不同水分的分布；并且，參與宰后糖酵解的酶(如磷酸果糖激酶)經亞硝基化修飾后，活性受到抑制，影響宰后pH下降速率及終點pH，進而影響肉品成熟品質。(4)蛋白磷酸化修飾對肌肉成熟存在影響；此外，當前亦發現熱休克蛋白等也參與了嫩化進程調控，需作進一步的研究。

圖2  多機制共同作用肉品成熟

　　由于結締組織強度增加和內源性蛋白水解酶能力不足，老齡動物特定肌肉仍具有相當大的韌性，因而可通過添加外源酶提高肉品嫩度。常用外源酶及其作用如表1所示。植物蛋白酶中以木瓜蛋白酶(papain)研究最為廣泛，其含有的巰基肽內切酶幾乎可水解所有的肽鍵，且在不同pH環境下均可分解蛋白?；钚詐apain不可直接注射活體動物，經H2O2氧化失活后頸靜脈注射，因宰后蒸煮缺氧條件而被重新激活，促進酶活性部位半胱氨酸殘基減少和肌肉中的結締組織及肌纖維中結構較復雜的膠原蛋白、彈性蛋白的降解。需要注意的是，不同研究者研究過程中所用酶濃度、純度各異，因而植物蛋白酶嫩化效果很難取得統一趨勢；除此之外，肉品切塊方式、存儲溫度及其余干預措施亦對嫩化效果存在影響。植物蛋白酶失活溫度高于微生物蛋白酶，高溫煮制可能導致過度嫩化，需將時間、溫度、酶-底物比等因素納入考慮。此外，相對于快速蒸煮肉塊，緩慢蒸煮過程中的蛋白酶水解活性表達更高，若需產生同快煮相同的嫩化效果，需降低慢煮過程中所添蛋白酶濃度。

　　傳統植物蛋白酶具有廣泛的特異性，易導致不良結果(漿糊質地、風味差)，而微生物蛋白酶具有自限活性的特點，且針對底物蛋白特異性強。例如，提取自米曲霉的天冬氨酸蛋白酶只作用于肌原纖維蛋白(MP)而對結締組織無影響；嗜堿芽孢桿菌的彈性蛋白酶對肌原纖維水解活性低而對彈性蛋白特異性強，進而可避免過度嫩化。外源酶應用于肉品嫩化，需要綜合考量其來源及商用制劑純度、有效使用水平的安全性、消費者可接受性、感官品質影響及成本。

　　2.2  化學法嫩化

　　2.2.1  鹽法嫩化

　　鹽類主要影響肉品功能特性，與肌肉收縮、蛋白質間相互作用、蛋白溶解度、酶活性及蛋白質晶格膨脹有關。如圖3（略）：

　　氯化物結合到纖維上增強纖維間排斥靜電力，造成蛋白晶格膨脹，膨脹的一個關鍵因素可能是在臨界鹽濃度下，去除肌原纖維中一個或多個橫向結構(可能是聯橋、M線或Z線)的約束。復合磷酸鹽可促進離子效應和pH變化，低濃度復合磷酸鹽(堿性)即可改變蛋白質電荷的電勢，進而提高離子強度，引起等電點偏離、電荷間相互排斥，蛋白間空間得以增大，促進肉組織包含更多水分；此外，還可提高膠原蛋白溶解度(膠原蛋白含量過多可降低肉品保水性能)、減少結締組織中膠原蛋白的交聯，從而改善肉品嫩度。多聚磷酸鹽可影響肌動球蛋白復合物的解離。鈣鹽最主要的作用是通過外加鈣提高肌肉體系中Ca2+濃度，進而激活鈣蛋白酶，引起相關組織結構破壞及纖維蛋白降解。亦有研究表明高濃度的Ca2+滲透肌細胞中，鈣激活中性蛋白(CANP)與堿性磷酸酶被激活，促進糖酵解，加速溶酶體破裂，組織蛋白滲出，共同促進了嫩度的提高。無磷保水劑不含磷酸鹽，同樣具有類似磷酸鹽的作用，以碳酸氫鈉(碳酸鹽，常作為無磷保水劑)為例，克服了磷酸鹽保水劑的缺陷，不用擔心添加量過高而影響產品的口感，但碳酸鹽一般呈堿性，對蛋白具有腐蝕作用，破壞蛋白組織結構，需要考慮營養損失情況。

　　由此可見，參與肉品嫩化的鹽類主要包括氯化物(鈉鹽與鈣鹽)、磷酸鹽(復合與多聚)、無磷鹽(碳酸鹽)等。涉及鹽法嫩化機制可簡述為：(1)提高肉品保水性；(2)降低膠原蛋白熱穩定性；(3)離子強度對蛋白質-蛋白質、蛋白質-水之間相互作用的影響；(4)蛋白水解酶(鈣蛋白酶)的激活。

　　2.2.2  有機酸嫩化

　　有機酸(醋酸、檸檬酸和乳酸等)嫩化肉品主要通過改變肌肉內部環境，進而改變鈣激活酶活性。以浸漬法和注射法為主，其作用機制可概述為：(1)影響肌原纖維主軸膨脹而使承載物質稀釋；(2)肌束膜中結締組織強度降低；(3)低pH值下的蛋白酶(主要是組織蛋白酶)加速了嫩化作用；(4)酸處理降低了肉的機械抵抗力。由于外源酸滲透緩慢，浸漬處理需要達到充分的浸漬時長，注射則可使酸溶液較快地擴散而加速嫩化。

　　2.3  物理法嫩化

　　2.3.1  傳統物理法嫩化

　　電刺激多用于大型動物(牛、羊、鹿等)，可加快ATP降解與糖元分解速度，pH下降，冷加工后可防止肌節縮短(冷收縮)；電刺激引起溶酶體水解酶的釋放，可破壞肌肉組織，加快蛋白水解，使肉質變嫩。水分灌注/增強技術(如鈣離子溶液注射技術)亦能有效改善肉品嫩度及多汁性。機械嫩化法則是通過對肉進行柔和切割，破壞肌間結締組織和肌纖維細胞以增強嫩度。尸僵時肉品嫩度與肌肉收縮程度密切相關，嫩度拉伸技術或其余拉伸技術則可通過施加與收縮張力相反的力，提高肌原纖維小片化指數，阻止肌節縮短，但也可能引起肌肉破壞和嫩化；而當前又出現智能拉伸技術，其不局限于完整酮體，且可減少冷凍室空間和能量需求、提高肉塊大小與形狀的控制，同樣具有良好的嫩化效果。但應用研究有限，尤其是針對肉塊拉伸和成形過程中分子變化的基礎研究不足，不同肌肉智能拉伸后肌節長度、峰值剪切力(PSF)和嫩化程度的差異等還未得到充分的理解；值得注意的是，肌肉收縮的程度隨肌肉類型而變化，反映在僵直期內的糖酵解、溫度與pH的變化，因此，對肌肉拉伸和成形進行研究相當重要，以確保在商業應用中取得一致的最終結果。傳統物理技術均取得一些成功應用，至今這些技術依然廣泛存在，但其具有在線應用差、當代消費者對技術的不可接受性等不可避免的缺陷，促使廣大研究者對新型物理嫩化的研究。

　　2.3.2  新興物理法嫩化

　　2.3.2.1  高壓加工技術

　　高壓加工技術(HPP)是一種通過液體介質對產品施加靜電壓力的技術，高壓應用時，會發生絕緣增熱現象(大氣受到壓縮而升溫，且無熱量損失)，HPP嫩化效果與宰后肉所處狀態密切相關。

　　僵直前肌肉中，HPP有效嫩化應用條件一般為氣壓100-235MPa、溫度10-35℃，該階段應用引起的嫩化是加速/阻止糖酵解的結果。僵直前肌肉因宰后缺氧，需進行糖酵解以維持ATP生成，同時乳酸積累，肌肉pH下降，壓力施加將導致肌原纖維結構大量破壞、Ca2+釋放加速糖酵解進程，促進僵直及后期成熟的發展。此外，亦有可能在壓力作用下，糖酵解酶發生變性，糖酵解停止，肌肉最終pH(pHu)得以上升，而pHu與嫩度存在二次型關系，pHu6.1時，韌性最高，高于6.1，則表現為嫩度提高/改善，因而當HPP應用于僵直前肌肉時，很難做到肌肉的可靠嫩化。僵直后肌肉中，常溫或低溫下施加高壓一般不引起嫩度變化，甚至有提高韌性的可能(只有少部分在常低溫下起到了嫩化效果)；而高溫下施加高壓通常會改善嫩度，當壓力處于150-400MPa、溫度高于50-60℃時，大部分實驗研究均表現出明顯的嫩化效果。

　　總的來說，常/低溫下HPP的應用，處理肉需處于僵直前狀態，且嫩化結果不穩定；而僵直后肌肉于高溫下進行 HPP的應用，可作為潛在的商業加工方法，HPP技術雖不再只視為傳統殺菌技術的替代工藝，但其存在市場局限性(色澤不穩定，且壓力應用越高，肉品視覺外觀變化越大，甚至有“熟”感)，HPP技術不太可能取代傳統肉類加工方法，可作為結合方法或現有方法的補充。

　　2.3.2.2  沖擊波加工技術

　　沖擊波(SW)，又稱流體動力學壓力，可于毫秒級內瞬間產生高達1GPa的壓力波，通常以水為液體介質對肉品進行施壓。SW有水下引爆炸藥(爆炸沖擊波)和水下放電(電生沖擊波)兩種產生方式，其應用于食品加工已不局限于早期的殺菌作用，在肉類促嫩方面已有大量研究開展。

　　圖4（略）為兩種沖擊波產生方式對肉品嫩化作用示意圖。肌肉由75%水分構成，沖擊波可在流體(水)或任何與水聲學匹配的物體中傳播，同時產生與水相匹配的機械阻抗，以產生“破裂效應”。肉品嫩化機制主要有兩種：(1)肌肉超微結構的破壞；(2)增強蛋白水解能力或加速成熟。Zuckerman等通過掃描電鏡觀察發現經SW處理過的肌內膜蜂窩結構變形為松散的網眼狀。早期研究發現，爆炸沖擊波引起牛背最長肌肌節I帶碎裂，Z線周圍出現鋸齒狀邊緣，表明肌原纖維遭受物理性破壞，纖維間距擴寬。此外，Bowker等經Western Blotting技術發現，SW將肌鈣蛋白-T降解為可表征肉品嫩化性能的小分子量蛋白片段(30KDa)。爆炸沖擊波因單位負載產生的能量較電生沖擊波脈沖能量大，其嫩化效果更明顯，但對處于很嫩狀態的肌肉(蛋白酶活性低、結締組織多、肌節長度相對較短)嫩化困難。此外，對處理肉包裝材料要求高，工業推廣受限，這歸因于爆炸型依賴技術存在潛在安全問題和技術挑戰，產品接受度低，基建造價高、器械耐久性差等。而后者可通過重復脈沖、優化脈沖頻率、能量設置等調節手段彌補差異。

　　鑒于兩種方式優缺點，今后研究可重點圍繞新型抗沖擊波包裝材料的開發、性能更好的沖擊波設備研制以及結合其余新型技術對處于不同狀態的肉品進行分段/聯合作用。

　　2.3.2.3  超聲波嫩化

　　如圖5所示，超聲是一種基于聲能的非熱技術，聲波在高低壓之間傳播引起微小氣泡震蕩并逐漸增大，直至氣泡破裂形成空化現象，氣泡內爆引起的微射流引起物體表面物理性破壞，破壞肌纖維，影響肉品嫩度。此外，空化作用亦會引起分子破裂，誘導自由基形成并加速化學反應，促進蛋白氧化，引起二硫鍵交聯和蛋白聚集物的形成，影響蛋白溶解度，宏觀上表現為肉質變硬，需合理控制超聲應用時間及強度。一般認為低強度超聲（＜10Wcm-2）對肉品嫩化效果不明顯，尤其以超聲浴池應用體現更明顯。肉品宰后時間影響超聲作用效應，宰后時間過長的肉品，肉品嫩度因內源蛋白酶水解相關蛋白而降低，超聲應用效果模糊；而僵直前肌肉應用主要評估超聲對僵直開始及成熟期相關蛋白酶的作用，雖觀察到肌節拉伸、Z線破壞，但似乎最終肉品嫩度并未改善，研究者們認為超聲應用于肉品應在宰后24h，肉品達到pHu以減少超聲嫩化可變性。超聲可改善肉中相關蛋白結構特性，激活ATP酶活性，增加巰基含量，多呈現較少的α-螺旋與較多的β-折疊，降低聚集體的形成，改善凝膠三維網狀結構，提高肉品持水性能。雖然當前超聲提高肉品保水性存在爭議，但多數學者認為合適的超聲強度能夠促進鹽或保水劑的滲透，聯合效應可進一步增強肉品保水性能。

　　引起肉品嫩化效應的可能機制總結如圖6（略)：(1)肌原纖維/組織結構的物理破壞；(2)蛋白水解能力提高，促進成熟過程中肉品的嫩化(如增加組織蛋白酶的釋放)；(3)膠原蛋白破裂；(4)細胞膜損傷；(5)空化效應及自由基的形成對蛋白質的理化破壞。

　　超聲嫩化技術應當著重基礎研究，需集中于評估超聲對肉微觀結構、酶活性及最終嫩度的影響，并優化工藝參數(頻率、強度和處理時間)。由于超聲波與肉品科學均復雜，因此超聲研究中必須提及所用裝置及實驗設定參數的具體細節，降低可重復性的難度(當前超聲嫩化肉品研究結果存在很大的可變性)，從而推進超聲嫩化的進一步發展。

　　2.3.2.4  脈沖電場嫩化

　　脈沖電場(PEF)作為改善食品結構及生物活性的綠色新型非熱技術，通過在兩個電極之間以直流電壓脈沖形成電場，亦可用于肉類嫩化。肉品組織由于細胞尺寸大，一般不需要高強度電場，形成孔徑的電場強度約在1-10KV/cm范圍內。肉品成熟前對肌肉進行PEF處理，可通過提高細胞膜通透性致使細胞器釋放鈣離子、鈣激活蛋白酶，從而促進肉的嫩化；宰后成熟的嫩化也得益于PEF對蛋白的水解，其余因素如溶酶體組織蛋白酶的釋放、僵直前肌肉中Ca2+釋放引起的糖酵解加速及肌肉的物理性破壞(但需要巨大的能量)也可能對肉品嫩度的提高有一定的貢獻。嫩度很大程度上取決于肌肉細胞的完整性，不同于電刺激及拉伸技術，在一定的條件下，不需要明顯的溫升，便可實現細胞膜的不可逆通透，PEF可作用于僵直前/后肌肉，但其研究結果卻相當有趣。

　　如圖7（略）所示，就僵直后肌肉應用而言，PEF處理后對嫩化進程有影響，過往研究對于“PEF 是否可以改善嫩度”結果不一致。主要矛盾點在于：(1)高強度PEF處理后，是否給予合適的成熟時間(肉品的嫩化是一個生化過程)；(2)低強度PEF是否誘導纖維物理破壞，即低強度PEF可能不足以誘導細胞膜的不可逆通透，細胞器釋放 Ca2+和酶能力受限；(3)肌肉的解剖學及生理學差異(會影響生熱、電導率、纖維類型組成及細胞膜特性)是否引起不同肌肉表現為頻率依賴性或重復依賴性。值得注意的是，高強度PEF作用可能會因為歐姆熱引起溫升，造成參與嫩化進程中蛋白與酶的變性、肉塊溫度的提高，從而致韌。就僵直前肌肉而言，研究表明不同部位肌肉可能會表現出截然相反的結果(不論單次應用還是重復應用)，這可能歸因于PEF對這些肌肉保水性的不同影響。

　　雖然當前PEF應用肉品嫩化研究有限，但其在嫩化進程中表現出潛在作用，不同肌肉類型需要不同的最佳參數，需要更多的研究以評估 PEF在商用型肉品中的肉而不是已經研究過的肉(多研究牛肉)，不同肌肉引起的嫩度差異需作進一步的研究，從而更好地理解PEF影響肌肉結構及嫩度的機理。此外，需探究不同強度PEF及重復次數的交互設計以獲得更理想的感官屬性。

　　3  討論

　　以上所述新興物理技術，就技術而言，主要是通過對肌肉結構的物理破壞、增強蛋白水解與加快成熟進程、促進肌肉相關蛋白的變性與溶解，以達到嫩化目的。這些新興嫩化技術能否獲得最佳利用，需針對不同胴體肌肉、不同市場(食品服務行業、鮮品、出口品)、不同消費群體喜好進行不斷地調整。過往研究表明，消費者愿意為有保證的嫩化肉多付費，因而這些新興技術會引起人們的興趣，這些技術在工業上的實施將取決于經營者的創新意愿、技術資本、運營成本與投資-效益價值。了解每種技術如何誘導嫩化的機制將有助于確定某一特定分割肉或特定市場所需的理想組合技術。即使當前多采用傳統與新興方法聯合處理，以取長補短，獲得“1+1＞2”的嫩化效果，但不可否認的是，這些新技術在商用中還不能大面積投入，成本因素之外，研究的重現性低，需進一步深化基礎研究。此外，加工方式如低溫長時蒸煮等也可嫩化肉品，亦可開發新型加工方式及工藝。最后，還需針對肉品嫩度無損檢測方法(如高光譜成像)及嫩度生物標記物(如熱休克蛋白)等作進一步地探索。